Publicarea unui proiect de secventa a 90% din genomul uman anunta o perioada stimulatoare pentru cercetarea din domeniul geneticii umane. In ultimii 20 de ani, eforturile oamenilor de stiinta s-au indreptat in directia inregistrarii si clonarii genelor pentru aproximativ 1000 de afectiuni genetice ale omului. Au fost impulsionate, astfel, serviciile complexe de diagnostic prenatal, testarea purtatorilor si testele presimptomatice ale unor afectiuni mendeliene, cum sunt fibroza chistica (mucoviscidoza) si distrofiile musculare. In ciuda rolului important pe care l-au jucat pentru familiile afectate de bolile respective, asemenea progrese au avut un impact limitat asupra sanatatii populatiei. Situatia s-ar putea schimba in cazul in care cunoasterea celor 2,9 gigabaze ale secventei genomului uman ne-ar permite sa identificam genele susceptibile pentru aparitia unor afectiuni comune, cum sunt diabetul, astmul si cancerul. S-ar mai putea identifica si variantele genetice care determina raspunsul organismului unui pacient la un anumit medicament. Chiar daca ar fi indeplinite numai unele dintre promisiunile secventei genomice, in decada urmatoare vom asista la utilizarea geneticii dincolo de granitele centrelor de specialitate, pentru a influenta diagnosticul si tratamentul afectiunilor comune la nivelul ingrijirilor primare.
Sunt afectiunile comune “genetice”?In general se considera ca riscul de a contracta afectiuni comune este determinat, in mare masura, de mediu si de stilul de viata. Exista, cu toate acestea, date epidemiologice importante, care atesta contributia genelor la riscul global. De exemplu, in scleroza multipla, descendentii unei persoane afectate prezinta un risc de 25 de ori mai mare de instalare a afectiunii, in comparatie cu populatia generala. Având in vedere faptul ca, de obicei, rudele au un mediu de viata comun, mostenirea unei afectiuni poate sa fie evaluata si prin comparatia intre ratele de concordanta ale unei afectiuni la gemenii monozigoti si la cei dizigoti. O crestere a concordantei, la gemenii monozigoti, in comparatie cu gemenii dizigoti ar sugera ca determinarea este in special de natura genetica. In cazul sclerozei multiple, concordanta este de 30%, pentru gemenii monozigoti, si de 3%, pentru gemenii dizigoti, ceea ce evidentiaza importanta determinarii genetice, existând, insa, si o componenta importanta, provenita din partea mediului.Scleroza multipla constituie un exemplu de afectiune complexa, la a carei patogeneza contribuie atât genele, cât si mediul. Exista si argumente care sustin ca, la susceptibilitatea la afectiune contribuie mai multe gene, fiecare dintre ele putând duce la o crestere modesta a riscului (probabil, pâna la o valoare de cinci ori mai mare). Din acest motiv, cazurile respective mai poarta si denumirea de afectiuni poligenice, iar genele de susceptibilitate sunt denumite si gene ale afectiunilor complexe.De ce sunt importante genele afectiunilor complexe?Daca se tine cont de faptul ca aceasta categorie de gene confera o crestere modesta a riscului si ca depistarea lor implica dificultati tehnice si costuri materiale ridicate, s-a pus intrebarea utilitatii unei asemenea investitii. Un argument important in favoarea depistarii este ca, astfel, ar deveni posibila identificarea persoanelor expuse riscului de instalare a unei anumite afectiuni. Desi neplacuta pentru persoanele “cu risc”, cunoasterea unor astfel de informatii si-ar gasi utilitatea atunci când cei in cauza ar putea sa evite factorii de mediu care declanseaza procesul de trecere de la stadiul de susceptibilitate genetica la cel de boala. Mai mult, identitatea unor astfel de gene ar dezvalui multe dintre caile moleculare care determina starea de boala, identificând, astfel, tinte noi si relevante pentru tratamentul medicamentos. Cercetarea ar mai putea sa aiba drept rezultat o taxonomie moleculara a afectiunilor, ceea ce ar spori specificitatea medicamentelor indicate in tratamentul subtipurilor de afectiuni si, implicit, le-ar creste mult eficienta.
[Image] Fig 1 Testarea lincajelor: cele doua alele ale polimorfismului sunt notate A si a. Fiecare parinte este heterozigot pentru polimorfism. Daca cele doua alele ar fi fost mostenite aleatoriu de catre perechile de descendenti afectati din fiecare familie, ne-am fi asteptat ca acestia sa aiba, in medie, una dintre cele doua alele parentale (50%). Perechile de descendenti afectati au, insa, patru din sase alele (67%). Testul de asociere: frecventa (%) alelei mai rare din polimorfismul mononucleotidic (alela a) este mai mare decât la grupul de control. Testul dezechilibrului de transmitere: in medie, ne-am astepta ca fiecare parinteCum pot fi descoperite genele afectiunilor complexe?Scanarea genomuluiDepistarea genelor afectiunilor complexe incepe cu identificarea locatiilor cromozomiale ale genelor pentru susceptibilitate la boala utilizând analiza lincajelor. In fig 1 este ilustrat principiul tehnicii. In familiile in care perechile de descendenti prezinta o afectiune, se face tiparea cu polimorfismul ADN (variatii comune ale secventei ADN) pentru a depista un polimorfism care sa fie mostenit, odata cu afectiunea, de-a lungul arborelui genealogic. Daca se constata ca alelele polimorfismului sunt distribuite excesiv in rândul unui mare numar de perechi de descendenti afectati, este probabil ca polimorfismul sa fie lincat de o gena care-i confera susceptibilitate pentru aparitia afectiunii. Depistarea polimorfismelor corelate cu boala presupune tiparea a 200-300 de familii din perechile de descendenti afectati cu 300-400 de polimorfisme amplasate uniform in cadrul genomului uman. Procesul este denumit scanare genomica.Localizarile cromozomiale ale unora dintre genele afectiunilor complexe Afectiunea Localizarea cromozomiala Maladia Alzheimer 12q, 19q13 Astmul 5q, 6p21, 12q Diabetul de tip 1 5q, 6p21 11p Diabetul de tip 2 1q, 2q37 Maladia inflamatorie a intestinului 6p21, 12, 16q Aceasta tehnica a fost utilizata pentru a localiza genele de susceptibilitate pentru multe dintre afectiunile complexe (tabel). Totusi, lincajele semnalate de un anumit grup de cercetatori nu au fost intotdeauna observate si de alte grupuri, cel mai posibil din cauza faptului ca studiul original fie nu a avut putere statistica (respectiv, a efectuat tiparea unui numar insuficient de perechi de descendenti), fie a ajuns la un rezultat fals pozitiv. De asemenea, pot sa existe seturi distincte de gene de susceptibilitate, care sa opereze in populatii diferite. Pâna ce nu se va observa ca lincajul este reprodus in cadrul a cel putin unui studiu independent de mari proportii, este oportuna manifestarea unei atitudini sceptice.
[Image]Fig 2 Analiza TaqMan de genotipare a polimorfismelor mononucleotidice: se prepara doua probe de ADN scurt, fiecare fiind complementara uneia dintre cele doua alele ale polimorfismului si marcata cu un colorant fluorescent diferit. O proba se leaga specific, in timpul reactiei, de alela tinta, se elibereaza colorantul si se masoara fluorescenta emisa. Raportul dintre fluorescentele emise de cei doi coloranti din fiecare esantion ofera indicatii despre prezenta alelei 1 (alb), a alelei 2 (gri inchis) sau a ambelor aleleOdata lincajul confirmat, poate incepe cautarea genei critice din interiorul regiunii lincate. In cazul afectiunilor comune, de regula, zona de lincaj este mai extinsa; astfel, este posibil sa cautam o gena intr-o portiune formata din 20-30 de milioane de perechi de baze care contin circa 500 – 1000 de gene. Cum putem noi sa identificam gena relevanta din acest adevarat “car cu fân” al genelor?Investigarea asocieriiPasul urmator porneste de la premisa ca susceptibilitatea este rezultatul unei mutatii (o variatie a secventei de ADN), produse intr-o gena, prin care se altereaza fie expresia, fie structura proteinei codificate. Exista probabilitatea ca mutatia sa nu fie rara la nivelul populatiei generale, spre deosebire de mutatiile genelor raspunzatoare de afectiunile mendeliene ale unei singure gene, care au o frecventa scazuta. De asemenea, se spera, desi inca nu s-a demonstrat, ca o singura mutatie specifica va raspunde de susceptibilitate la majoritatea pacientilor dintr-o anumita populatie. Este de asteptat ca mutatia sa fie un polimorfism mononucleotidic (SNP), care este o variatie frecventa a secventei de ADN ce altereaza o singura baza dintr-o anumita secventa a ADN. Asadar, al doilea pas al “vânatorii” de gene este explorarea regiunii lincate pentru a gasi polimorfismul mononucleotidic care sa ateste asocierea cu fenotipul afectiunii. Testarea asocierii se poate face printr-un studiu conventional cu control de cazuri, cautând diferenta dintre frecventa unei alele a polimorfismului mononucleotidic in rândul pacientilor ce sufera de afectiunea respectiva si cazurile de control alese adecvat (fig 1). Cu toate acestea, o capcana care poate sa duca, frecvent, la asociatii fals pozitive este reprezentata de gradul scazut de concordanta intre cazuri si grupurile de control, in ceea ce priveste originile etnice sau cele geografice; frecventa de aparitie a polimorfismelor mononucleotidice poate sa prezinte variatii mari in rândul diferitelor populatii, chiar si pe teritoriul Insulelor Britanice.Celalalt inconvenient important este reprezentat de faptul ca, adesea, numarul de esantioane este prea mic, ceea ce poate conduce la obtinerea de rezultate fals pozitive (sau fals negative). Este disponibila alternativa tehnicii bazate pe familii, cu teste ale transmiterii preferentiale ale unei alele din polimorfismul mononucleotidic de la parintii heterozigoti la un descendent afectat. Tehnica este cunoscuta sub numele de test de transmitere dezechilibrata, prin care se evita unele dintre neajunsurile ivite ca urmare a etapei de selectare a populatiei de control (fig 1). Ambele tehnici se bazeaza pe presupunerea ca polimorfismul mononucleotidic testat fie constituie varianta reala a secventei care produce susceptibilitatea genetica, fie este in dezechilibru de lincaj cu adevarata alela de susceptibilitate. In dezechilibrul de lincaj, una dintre cele doua alele ale polimorfismului mononucleotidic este asociata intotdeauna (sau aproape mereu) cu alela de susceptibilitate efectiva, aratând, prin aceasta, si asocierea cu afectiunea. Cercetarea asocierii poate sa fie aleatorie (testarea polimorfismelor mononucleotidice la intervaluri regulate, de-a lungul regiunii critice) sau prin utilizarea unei tehnici a genei candidate, care testeaza polimorfismele mononucleotidice in rândul genelor de interes deosebit. Genele candidate sunt selectate in functie de urmatoarele criterii: sa aiba o functie cunoscuta sau previzibila si un profil de expresie concordant cu fenotipul afectiunii. Ambele tehnici presupun testarea polimorfismelor mononucleotidice la intervaluri apropiate, deoarece, in general, dezechilibrul de lincaj se mentine pe regiuni genomice mici, de aproximativ 5 000-50 000 bp din ADN.Importanta depistarii genelor afectiunilor complexe a dus la initiativa colectarii esantioanelor de ADN de la un numar mare de pacienti ce sufera de afectiuni comune. In Marea Britanie a fost coordonat un studiu prospectiv, efectuat pe 500 000 de adulti din populatia generala, cu scopul de-a examina interactiunile genelor cu factorii de mediu si cu factorii de risc ai stilului de viata.Tehnologiile moderneDepistarea genelor critice poate fi ghidata si transformata intr-o activitate de maxima importanta printr-o investigare electronica a regiunii, utilizând analiza bioinformatica. Va fi cunoscuta, astfel, secventa celei mai mari parti a regiunii lincate, dar, pâna ce nu va fi descifrata, rezultatul nu va putea fi exploatat. Adnotarea este procesul de convertire a secventei neprelucrate de ADN in cunostinte de biologie si anticipeaza care dintre bitii secventei codifica genele reale si ce fel de proteine sunt codificate de genele respective. Programele de predictie genetica scaneaza secventa proprietatilor generale ale secventelor de codificare a proteinelor, in timp ce altele cerceteaza toate bazele de date disponibile ale secventelor pentru depistarea genelor omoloage cunoscute de la alte organisme. Pâna in prezent s-a facut multa adnotare, iar hartile genetice ale tuturor regiunilor cromozomiale pot fi gasite in bazele de date publice, cum ar fi, de pilda, in cadrul National Centre for Biotechnology Information (Centrul National de Informatii Biotehnologice). Analiza ar mai putea sa permita deducerea functiei unor noi gene umane, in cazul in care structura este omoloaga cu cea a unei gene a carei functie este cunoscuta intr-un alt organism. Bazele de date detin si informatii referitoare la profilul de exprimare a genelor in tesuturi si organe, care ar putea oferi indicii referitoare la o posibila functie.De indata ce un set de gene a fost selectat pentru studiu se face screeningul polimorfismelor mononucleotidice. Ulterior, polimorfismele sunt genotipate in colectii mari ale ADN-ului pacientului, pentru a se determina eventuala asociere cu afectiunea. Cele mai multe dintre gene vor contine polimorfisme mononucleotidice, dintre care unele sunt cunoscute si inregistrate in bazele de date electronice. Prin scanarea segmentelor de gene, utilizând una dintre numeroasele metode disponibile, in prezent, pentru depistarea mutatiilor, se vor descoperi si alte polimorfisme mononucleotidice. Un consortiu international de companii farmaceutice, impreuna cu Wellcome Trust, cerceteaza polimorfismele mononucleotidice de la nivelul intregului genom uman, oferind informatiile, fara nici o restrictie, publicului larg. In datele pe care consortiul le avea inregistrate in luna decembrie a anului 2 000 erau semnalate 800 000 de polimorfisme mononucleotidice, iar peste 2,5 milioane au fost inregistrate in baza internationala de date pentru polimorfisme mononucleotidice a National Centre for Biotechnology Information.Analiza asocierilor genetice cu afectiunile comune presupune o tehnologie care sa permita o trecere in revista de calitate inalta. Un studiu tipic al unui locus genetic ar putea sa implice tiparea, in 2 000 de esantioane, a 1 000 de polimorfisme mononucleotidice diferite, ceea ce ar duce la obtinerea a doua milioane de genotipuri. In acest scop au fost elaborate diverse tehnici, inclusiv spectrometria de masa si microtestarea de inalta densitate (sau chips-uri). In fig 2 este ilustrat exemplul unei tehnici automatizate (TaqMan). Aceasta permite citirea, in numai câteva secunde, a unei placi cu 96 de probe de ADN, semnalul fluorescent din fiecare godeu fiind convertit instantaneu intr-un genotip. Tehnicile existente au capacitatea de-a produce zeci de mii de genotipuri dintr-o singura prelucrare, in decurs de o saptamâna, ceea ce inseamna ca, odata ce au fost identificate variantele genetice potential utile dintr-o gena de susceptibilitate, exi

sta mijloacele tehnologice necesare pentru a le tipa rapid si ieftin, pentru un numar mare de pacienti.Realizari si perspectiveRealizarile inregistrate in ceea ce priveste depistarea genelor afectiunilor complexe au aparut cu intârziere, dar rezultatele recente ne ofera suficiente motive sa fim optimisti. De exemplu, in maladia Alzheimer, o combinatie intre analiza lincajului si concentratiile plasmatice ridicate ale colesterolului, la familiile cu debut tardiv al bolii, a atras atentia asupra genei apolipoproteinei E de pe cromozomul 19. S-a dovedit, ulterior, ca exista o legatura strânsa intre riscul crescut de aparitie a maladiei Alzheimer si alela varianta e4 a apolipoproteinei E.11 La populatia alba, heterozigotii e4 prezinta un risc dublu pâna la triplu de instalare a maladiei Alzheimer, iar homozigotii e4 sunt expusi unui risc de 15 ori mai mare. In conditiile in care nu exista, inca, posibilitatea vindecarii maladiei Alzheimer, cunostintele nu sunt utile pentru testarea preventiva a indivizilor neafectati, dar pot fi valorificate in cadrul conduitei terapeutice. Probabilitatea de a beneficia de tratamentul cu medicamentul colinomimetic tacrin este mai mica in cazul pacientilor cu maladia Alzheimer, care prezinta subtipul e4, decât la bolnavii fara acest subtip. In ultimele luni, studiul diabetului a inregistrat rezultate deosebite. In 1996, prin analiza lincajului, s-a semnalat existenta unei gene a diabetului de tip 2, localizata pe cromozomul uman 2.13 Analiza sistematica a polimorfismelor mononucleotidice din regiunea lincata a aratat, in prezent, o legatura strânsa intre diabetul de tip 2 si o gena a proteazei calpain, CAPN. S-a mai semnalat o legatura strânsa intre un polimorfism mononucleotidic in gena interleukinei 12 (p40) si diabetul de tip 1. In studiile respective, mai multe polimorfisme mononucleotidice din genele candidate erau strâns corelate cu afectiunea, astfel incât nu este inca limpede care dintre ele confera, de fapt, susceptibilitatea. Confirmarea finala va fi oferita de studiile functionale, de exemplu, prin evidentierea unui efect biologic al unei variante specifice, dupa analiza afectiunii pe modele animale sau celulare.Ritmul descoperirilor polimorfismelor mononucleotidice si progresele in genotiparea de inalta rezolutie ar trebui sa aiba ca efect identificarea, in urmatorii cinci-zece ani, a unui mare numar de gene de susceptibilitate pentru afectiuni complexe. Asemenea cunostinte vor putea fi aplicate in practica in multiple modalitati. Sa luam exemplul ipotetic al unei femei in vârsta de 45 de ani, hipertensiva, la care s-ar preleva un esantion de raclaj bucal pentru testarea genetica ce ar permite clasificarea moleculara a afectiunii in tipul I, II sau III. Ar urma ca, in conformitate cu subtipul de afectiune, sa i se prescrie un medicament specific impreuna cu recomandarile igieno-dietetice de rigoare. In cadrul unor testari preventive, un baiat in vârsta de cinci ani, al carui frate mai mare prezentase crize de astm, ar putea fi verificat in ceea ce priveste prezenta unor gene de susceptibilitate la astm: testarea s-ar face dupa obtinerea consimtamântului parintilor si dupa o consiliere adecvata. In cazul unor rezultate pozitive i s-ar putea prescrie medicamente profilactice antiastmatice. In urmatorii zece ani, genotiparea ar putea sa fie integrata, astfel, in tratamentul curent al unui numar din ce in ce mai mare de afectiuni.