Hormonii se pot defini ca substante organice de natura endogena, secretate in cantitati extrem de mici de glande endocrine sau de alte tesuturi specializate, care patrund prin circuitul sanguin in tot organismul si au proprietatea de a stimula si coordona functionarea unor organe sau tesuturi-tinta, procese metabolice sau activitatea intregului organism. Deci hormonii isi manifesta actiunea asupra unor organe si tesuturi mai indepartate de locul secretiei, fara a exclude posibilitatea lor de a actiona si asupra unor celule si tesuturi foarte apropiate de locul de secretie(cazul testosteronului). Actiunea inalt specializata a hormonilor nu este receptionata decat de formatiuni celulare caracteristice si capabile de a intercepta actiunea unui hormon, care are o anumita structura chimica.
Cuvantul hormon provine din limba greaca(hormao= a excita, a stimula, a activa, a pune in miscare) si a fost introdus in stiinta de catre Ernest Henry Starling (1866-1927) in anul 1905. Necesitatea introducerii unui termen stiintific cu caracter de generalizare s-a ivit imediat dupa ce au fost cunoscute substante biologic-active care isi manifesta actiunea biostimulatoare mai departe de locul secretiei. In acest sens se poate exemplifica descoperirea secretiei de catre Bayliss si Starling (1902), hormon care stimuleaza secretia pancreasului( secretina fiind un hormon tisular produs de mucoasa duodenala).
Cel care intuieste pentru prima data existenta unor secretii interne a diferitelor organe este medicul francez Theofile de Bordeu (1775),ce poate fi conjsiderat un premergator al endocrinologiei. Karl Adolf won Basedow(1799-1854) si predecesorii sai Caleb Ilillier Parry si Robert James Graves descriu hipertiroidismul(1825-1840). Observatii asupra functionarii glandelor suprarenale Thomas Addison (1793-1860) care, in 1855, a descris insuficenta corticosuprarenala, cunoscuta sub numele de boala lui Addison.
In anul 1855, filozoful francez Claude Bernard (1813-1878) a introdus termenul “secretie interna”, facand diferenta inter secretiile glandulare externe si interne, putand fii considerat un pionier al endocrinologiei. El a pus in evidenta functia glicogenetica a ficatului si rolul pancreasului in digestia grasimilor, facand dovada secretiei interne a unui organ.
Unul dintre fondatorii acestei discipline stiintifice pe plan mondial si intemeietorul scolii romanest de endocrinologie este savantul Constantin I. Parhon(1874-1969) care impreuna cu M. Goldstein au publicat la Paris(1909) prima carte din lume ce trateaza probleme de endocrinologie cunoscute la acea vreme, intitulata : Les Secretion Internes (Pathologie et Physiologie).
Glandele sunt organe existente in corpul uman si animal unde au rol de a elabora si secreta anumite substante, unele biologic-active.
Dupa mediul in care isi expulzeaza secretia, glandele se clasifica in glande exocrine sau cu secretia externa si glande endocrine sau cu secretia interna. Din prima categorie fac parte glandele salivare, stomacale, intestinale, mamare, sudoripare si altele. Din cea de a doua categorie fac parte alte glande care sunt lipsite de o conducta de eliminare, produsele lor de secretie patrunzand direct in sange, deci intr-un mediu din interiorul organismului(endo-inauntru si crincin-a elimina). Unele glande au caracter mixt, de exemplu pancreasul, ovarele.
Existenta unor organe cu rol major in coordonarea proceselor biologice a fost observata inca din antichitate : Hipocrat din Kos(460-375 i.e.n), Galenus (130-200 sau 210)
Glandele endocrine prezinta cateva proprietati particulare si anume o structura histologica proprie, fiind alcatuite din celule in care se produce biosinteza hormonilor care, dupa secretie, patrund direct in sange. Celulele secretoare sunt specializate, ele avand proprietatea de a produce compusi biologic-activi, care au o anumita structura chimica. Cantitatea de hormon secretata este variabila, activitatea glandei fiind reglabila. Exista o stransa legatura intre functionarea glandelor endocrine si produsele biologic-active secretate de ele, adica hormonii secretati pot interveni stimuland sau inhiband activitatea de secretia a altor glande.
Se cunosc mai multe criterii de clasificar a hormonilor :
a) Dupa glanda in care sunt elaborati : hormoni tiroidieni, suprarenali, sexuali, epifizari si ai glandei timus. Se observa ca, dupa aceasta clasificare, hormonii au structuri chimice si proprietati biologice diferite.
b) Dupa structura chimica a moleculei :
-hormonii derivati din aminoacizi (tiroxina, adrenalina, noradrenalina si alti)
-hormoni peptidici si proteici avand moleculele formate prin incatenarea aminoacizilor prin legaturi peptidice. Ca exemple de hormoni peptidici : hormonii pancreatici (insulina si glucagonul) si ai hipofizei posterioare (ocitocina si vasopresina) etc. Hormonii proteici au molecula alcatuita dintr-un numar mare de aminoacizi incatenati de asemenea prin legaturi peptidice, formand macromolecule proteice : hormonul paratiroidian (parathormonul), hormonii hipofizei anterioare (hormonul de crestere, hormonul adrenocorticotrop etc), hormonii hipofizei intermediare. Hormonii cu structura proteica se numesc si preteohormoni ;
-hormoni steroizi, deriva
ti ai sterolilor : hormoni cortico- suprarenali si sexuali (hormonii ovarieni si testiculari).
c) Se poate considera si un al treilea criteriu de clasificare a hormonilor, acela al proceselor biologice asupra carora ctioneaza hormonii : hormoni cu actiune metabolica, hormonii cu actiune morfogenetica, hormoni cu actiune endocrina, deci care actioneaza asupra functiei altor glande.
PANCREASUL, asezat in spatele partii inferioare a stomacului, a fost descris pentru prima oara in 1642 de catre medicul bavarez Wirsung. Pancreasul poate fi regasit la toate animalele vertebrate. La om, el are o forma alungita, putandu-se deosebi trei parti ale organului: capul, corpul si coada pancreasului. Greutatea sa oscileaza intre 70 si 160 g la omul adult.
Din punct de vedere functional, pancreasul reprezinta o glanda mixta, avand o secretie externa si una interna. Ca organ exocrin, glanda produce si varsa in duoden, prin canalul lui Wirsung, sucul pancreatic, format dintr-o serie de fermenti si avand un rol important in procesele de digestie intestinala ale glucidelor, lipidelor si proteinelor. Sucul pancreatic este produs de tesutul acinar al glandei. In afara de acini, pancreasul contine formatii celulare raspandite printre tesutul acinar, frecvente in special in regiunea cozii organului, denumite insulele lui Langerhans, dupa numele autorului care le-a descris pentru prima oara in 1869. Laguesse (1895) a pus in evidenta rolul endocrin al insulelor lui Langerhans, a caror secretie a fost numita (1909) de catre Meyer “insulina”,denumire sugerand provenienta. Insulele lui Langerhans sunt alcatuite din celule diferite :
celule α, mai voluminoase, in proportie de 20-25%,care secreta glucagonul ;
celule β,mai mici,in proportie de 65%, care secreta insulina ; celule γ,in proportie de circa 5%, care secreta vagotonina si urme de gastrina ; celelalte tipuri de celule, in proportie de 5%, sunt celule δ sau inca alte doua tipuri de celule ;dintre acestea, celulele δ par sa aiba o modesta functie endocrina, elaborand un polipeptid numit somatostatina,care are o viata scurta ;este eliberat si de hipotalamus.
O data importanta in istoria studiului pancreasului este anul 1889, cand Mering si Minkowski au obtinut la caini sindromul de diabet zaharat prin extirparea totala a glandei.Aceasta experienta a contribuit hotarator la stabilirea originei unei boli cunoscute de milenii si a deschis calea catre descoperirea activitatii endocrine a pancreasului. Cu studiul pancresului s-a ocupat si fiziologul roman Nicolaie Paulescu(1869-1931), care a obtinut pentru prima data (10 aprilie 1921) un extract pancreatic cu actiune hipoglicemianta, pe care l-a numit “pancreanina”. Putin mai tarziu (1922), insulina a fost izolata de catre Banting si Best, cercetatori canadieni, care au prelucrat pancresul bovinelor. Abel si colaboratorii au reusit sa obtina insulina sub forma cristalina(1926). Structura chimica si proprietati ale insulinei
Prin cercetari foarte laborioase interprinse de E. Sanger, Tuppy si Thompson, s-a putut stabili structura chimica a insulinei, ca fiind un polipeptid alcatuit din 51 resturi de aminoacizi.Molecula insulinei contine doua catene polipeptidice : A si B. Prima este alcatuita din 21 resturi de aminoacizi, are caracter acid si este spirala dreapta, iar catena B are 30 de resturi de aminoacizi, este bazica si spirala stanga.
Cele doua catene polipeptidice sunt unite prin punti disulfurice –S-S- ;exista doua astfel de punti, foarte sensibile la oxidare cand, in prezenta de acid performic, se transforma in grupe sulfonice (-SO3H).S-au identificat 17 aminoacizi diferiti in structura insulinei, unii dintre ei repetandu-se, de exemplu :glutamina, asparagina, leucina, cisteina, glicina, tirozina, fenilalanina, alanina.
S-a precizat ca legatura disulfurica intre cele doua catena se stabileste intre cisteina 7 din catena A si cisteina 7 din catena B, iar cea de a doua punte se stabileste intre cisteina 20 din catena A si cisteina 19 din catena B. Mai exista si o a treia punte disulfurica, care nu este intercatenara, ci intracatenara, stabilita intre cisteina 6 si cisteina 11, apartinand catenei A ;de aceste doua molecule de cisteina mai sunt legati inca patru aminoacizi, formand un ciclu, molecula de cisteina 7 din acest ciclu contribuind la reticularea celor doua catene A si B. S-a stabilit secventa aminoacizilor in molecula insulinei, care in cazul cand aceasta provine din pancreasul bovinelor are greutatea moleculara 5734 si poate fi reprezentata in felul urmator :
_____
1 ½ 7 8 9 ½ 21
catena A H-(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)-OH
½ ½
1 ½ 30
catena B H-(FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT)-OH
A Ala G Gli N Asn V Val
B Asx H His P Pro W Trp
C Cis I Ile Q Gln X ?
D Asp K Lis R Arg Y Tir
E Glu L Leu S Ser Z Glx
F Phe M Met T Tre
Desi pe cale analitica rezulta existenta a 51 resturi de aminoacizi in structura chimica a insulinei, asa cum rezulta si din formula polipeptidica de mai sus, se poate interpreta totusi ca exista numai 48, deoarece se poate admite ca cele trei punti disulfurice sunt cistinice, ele apartinand unui singur aminoacid (cisteina), care este singurul ce poate lega covalent, reticuland, cele doua catene polipeptidice.
Insulina e prezinta sub forma de pulbere alba, care se topeste la 233ºC,are masa moleculara relativa in jur de 6000 uam, pHi =5.4.Este solubila in mediu slab acid, la pH=5-6, in solutii alcaline diluate, in alcool de 90%, in glicerina, in fenol. Este insolubila in alcool absolut, cloroform, eter, acetona, benzen. Fermentii proteolitici o distrug, motiv pentru care insulina ca medicament nu poate fi introdusa in organism pe cale orala. In mediu alcalin, are proprietatea de a forma asociatii moleculare de diferite marimi, avand masa moleculara de la 36000 la 48000, asociatii determinate de cationii metalici. In organism ea se gaseste complexata cu cationi de zinc.
Biosinteza insulinei
Fiind un compus protidic, biosinteza insulinei are loc la nivelul ribozomilor din reticulul endoplasmatic din constitutia celulelor β ale insulelor Langerhans. Se admite ca, mai intai, are loc sinteza unui compus polipeptidic, cu greutate moleculara mai mare decat a insulinei, numit proinsulina.La randul ei proinsulina ar rezulta prin hidroliza enzimatica din alt compus, cu greutate moleculara si mai mare, numit preproinsulina, dupa schema :
Preproinsulina → Proinsulina → Insulina
Proinsulina care apare la nivelul ribozomilor este transformata in insulina, in cursul trecerii ei spre complexul Golgi.
Descoperirea proinsulinei a rezultat din studiul adenomului insular secretor de insulina. La probe in vivo, proinsulina prezinta numai 15-20% din activitatea insulinei. Ea contamineaza produsele uzuale de insulina si reactioneaza cu antiserurile folosite in radioimunoanaliza (RIA), dar nu reactioneaza identic cu serurile antiinulina purificata.
S-a pus in evidenta de catre Chance, care a izolat proinsulina din pancreasul porcinelor, ca aceasta este alcatuita din 84 resturi de aminoacizi. Structura proinsulinei de porc :
Asa cum se poate obesva din figura, proinsulina se diferentiaza de insulina printr-un peptid format din 33 resturi de aminoacizi. Este de remarcat ca acest polipeptid care se detaseaza nu se gaseste la unul din capetele catenei polipeptidice a proinsulinei si nici nu contine aminoacizi cu sulf (cisteina) ; el face legatura intre cele doua catene A si B ale insulinei si este numit peptid de legatura. Este eliminat prin actiunea hidrolitica a unei enzime protolitice de tipul tripsinei, care scindeaza legatura peptidica , din pozitia 32-33 si 62-63, iar sub influenta unei carboxipeptidaze se pun in libertate trei molecule arginina (pozitiile 31, 32 si 63) si o molecula de lizina (pozitia 62). Eliberarea insulinei de proinsulina se poate schematiza in modul urmator :
Se obtine industrial prin extractie din pancreasul animal si prin biosinteza cu bacterii sau drojdii manipulate genetic. Foarte bune sunt si insulinele bovina si porcina, care difera doar prin succesiunea aminoacizilor 8-10 din catena A. La bovine aceasta succesiune este ASV (si 30T este inlocuita cu 30A ), la ovine AGV, lacabaline TGI. La insulina porcina si cea de iepure, foarte asemanatoare celei umane, succesiunea este aceeasi (TSI) dar, ca si la bovine, apare Ala in locul 30Tre. Prin scindarea cu tripsina a alaninei finale rezulta desalanino-Ins porcina, inca mai asemanatoare ca proprietati celei umane. In urmatorul tabel se dau pozitiile si resturile de aminoacizi prin care difera diversele insuline.
|
Specie
|
Catena A
|
Catena B
|
|
Homicide
Porcine
Bovine
Ovine
Cabaline
Sobolan
|
4 8 9 10
E T S I
E T S I
E A S V
E A G V
E T G I
D T S I
|
1 3 29 30
F N K T
F N K A
F N K A
F N K A
F N K S
F K M S
|
Obtinerea insulinei se face prin procesul extractiv din pancresul porcin sau/si bovin sau prin biosinteza cu folosirea bacteriilor manipulate genetic.
Prcesul clasic de obtinere a insulinei se mai aplica inca (?) la Biofarm-Bucuresti, sectia “opoterapice”, unitate in care se obtin si alte preparate de extractie din tesuturi animale si vegetale utile terapeutic. Este format din etapele de extractie, debalastare de proteine, debalastare de lipide, precipitere a produsului brut si recristalizari multiple pana la o concentratie de 24 UI/mg proteina (fata de un etalon international care in 1982 mai era de 22,1 UI/mg proteina).
Se prelucreaza amestecul 1:3 de pancreas bovin (mult) si porcin (bun) refrigerat la -20ºC in abatoare pentru conservare, depozitare si transport. Modul de conservare se apreciaza prin indicii de alterare (indicele de formol<5).
Procesul se bazeaza pe solubilitate in mediu acid, in mediu alcalin si in alcool 90%, insolubilitate in acetona, scaderea solubilitatii la salefiere si solubilitatea minima la pH=6.1 (izoelectric) a complexului cu zinc a amestecului de insulina porcina si bovina. Se exploateaza stabilitatea in mediu acid si se evita mediul alcalin, in care insulina este instabila. Se aplica metodele de precipitare cu solvent, la pHi si in mediu salin si se utilizeaza proprietatile amfotere ale proteinelor.
Amestecul de pancreas se macina fin si se extrage 3 ore cu etanol 93% acidulat cu acid clorhidric la pH=2-3. Se centrifugheaza si turta de tesut se mai extrage o data timp de 2 ore cu alcool acidulat. Dupa filtrare tesutul epuizat se arunca.Filtratele, eventual filtrate inca o data, se aduc cu solutie amoniacala la pH=7-7.5, cand o parte din balastul proteic precipita si se centrifugheza (se trece la recuperarea alcoolului). Aceasta operatie se face rapid pentru a evita inactivarea in mediu slab bazic. Filtratul se aduce cu acid sulfuric la pH=3.7-4.3 cand precipita alt balast proteic, care se indeparteaza prin filtrare.
Solutia alcoolica diluata se concentreaza la maxim 30ºC/30 torr la 1/10 din volum, cand se recupereaza majoritatea alcoolului folosit. Ramane un concentrat apos de insuline brute, in care lipidele nu mai sunt solubile. Pentru a nu se pierde insulina, se aduce cu acid sulfuric la pH=2.2-2.5 , unde insulina este stabila si solubila, apoi la cald se filtreaza un balast lipidic. Solutia limpede se satureaza cu sare, solutia salina se raceste la 5-10ºC, cand precipita insulina bruta, care se ridica la suprafata saramurii ca o turta compacta. Se colecteaza manual. Din saramura si depozitul de sare se recupereaza resturile de insulina bruta. Prin diluare cu apa la 20%NaCl depozitul de sare se solubilizeaza si se recupereaza resturile.
Pentru purificare se apeleaza la pH-ul izoelectric al complexului Zn.I. Acesta este distrus in mediu acid, in care I este stabila si solubila, iar in mediu alcalin ionul de zinc se elimina fie ca ZnO fie ca si complex [Zn(NH3) 2]2+. In pH=6.1 , relizat cu tamponul acid citric/citrat de amoniu, solubilitatea este minima si produsul precipita sau cristalizeaza functie de viteza de insolubilizare.
Toate operatiile in continuare se executa in camera frigorifica pentru a preveni inactivarea I la pH≥7, iar aducerea la 6.1 se face totdeauna din mediu acid.
Pentru aceasta produsul brut se solubilizeaza la t=5ºC in solutie apoasa acetonica cu AcOH, apoi cu amoniac se aduce la pH=6.1. I ramane solubila in schimb impuritati proteice precipita si se indeparteaza prin filtrare. Prin introducere de acetat de zinc la solutia tamponata la 6.1 precipita Zn.Ins purificata si precipitatul floconos amorf se filtreaza dupa pastrare 24 de ore la 0-5ºC.
O forma mai pura rezulta la cristalizarea acestuia in aceleasi conditii. Precipitatul se solva in solutie apoasa acida (acid clorhidric si acid citric) se reduce constanta dielectrica cu acetona si se adauga sare de zinc pentru stabilizarea Zn.Ins. Se aduca la pH=7-7.5 cu amoniac , apoi la 6.1 cu acid citric, cand incepe sa precipuite insulina. Dupa doua zile la 0°C se centrifugheaza o forma cristalizata , care se spala si se usuca la 20°C la aer.pentru purificare avansata cele 15 g produs, obtinut din 150 kg amestec de pancreas,se recristalizeaza in laborator dupa acelasi tipic (dizolvare in mediu acid, tratare cu acetona si sare de zinc filtrarea impuritatilor, trecerea la pH=7.5 cu amoniac apoi la pH 6.1 cu acid citric si critalizare 1-2 zile la 0°C).Dupa cele doua recristalizari si uscare se ajunge la insulina de 24 UI/ml cu randament de 60% fata de Ins purificata cristalizata.
Insulina cristalizata mai contine cateva componente , unele alergene.Prin gel-cromatografie pe Sephandex s-au putu separa trei fractii: una are M»20 000, contine proteine pancreatice si fractii insulinice cu potential alergent; o a doua contine proinsulina si insuline modificate (Arg-Ins,desamido-Ins) si a treia cu continut de insulina, esteri ai sai si unii derivati. Prin cromatografie pe ioniti, din ultima se obtine produsul pur, insulina “Sanger” sau monocomponente (MC). Insulina bovina , cu trei aminoacizi diferiti este mai antigenica decat cea porcina , cea amorfa mai mult decat cea cristalizata , formele insolubilizate mai mult decat cele instant. Cele mai multe preparate MC retard sunt constituite din 30% insulina porcina amorfa si 70% bovina cristalizata. Este necesara HuIns pura.
Insulina umana nu se poate obtine in cantitati industriale prin procesul extractiv din pancreas. Ea s-a putut obtine doar ca urmare a aparitiei ingineriei genetice. In 1978 80% din piata insulinei era condusa de Ely-Lilly Co. si valora cam 150 milioane dolari, astfel incat dupa grefarea genei insulinei umane in E.coli la Genentechn, Ely-Lilly Inc. a incheiat un contract pe termen lung cu aceasta si se construieste rapid o instalatie in valoare de 40 milioane dolari pentru producerea insulinei umane. Din 1980 se putea produce deja si proinsulina, care este mai stabila si su poate sinda enzimatic sau cu bromcian la insulina.
Cum era cuoscuta succesiunea aminoacizilor din HuIns, sa apelat la sinteza pe cale chimica a genelor din cele doua lanturi in locul cautarii acestora in ARNm din tesutul animal. In plus, produsele apar in cantitatile si puritatile dorite, intr-un proces controlabil usor prin metodele chimice traditionale, mult maiieftine si simple decat cele din chimia ARN. Cunoscuta fiind succesiunea nucleotidelor, s-a construit prin metoda blocurilor de pentameri si decameri cele doua gene avand la extremitati situs-uri de scindare cunoscute. Pentru lantul A, s-a adaugat la capatul aminic formil-metionina, semnal de capat de catena, si grupa de nucleotide caracteristice recristazei EcoRI, iar la capatul carboxilic codoni de finalizare si secventa pentru Bam I. Pentru lantul B se procedeaza in mod similar, folosind aceleasi secvente terminale pentru enzime de restrictie.
1 21
catena A H-(GIVEQCCTSICSLYQLENYCN)-OH
1 21
EcoRI fMet Gli Ile Val………Asn Tir Cis Asn Stop Stop BamHI
½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½
½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½
gena A 5’AATTC ATG GGG ATC GTT……TTA TGC AAT TGA TAA ½ 3’
3’ GTAC CCC TAG CAA……AAT ACG TTA ACT ATT CTAG 5’
1 30
catena B H-(FVNQHLCGSGLVEALYLVCGERGFFYTPKT)-OH
1 30
EcoRI fMet Phe Val Asn Glu……Pro Lis Tre Stop Stop BamHI
½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½
½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½
gena B 5’AATTC ATG TTC GTC ………CCT AAG ACT TAA TAG ½ 3’
3’ GTAC AAG CAG………GGA TTC TGA ATT ATC CTAG 5’
Ideea este sa se obtina prin biosinteza (in vivo) cele doua catene si sa se realizeze cele doua punti cistinice prin oxidare ulterioara cu aer in vitro. Cele doua gene sa fie introduse in acelasi vehicul. Drept vehicul s-a ales plasmida pBR 322 bine cunoscuta, studiata si aplicata. Cum aceasta contine segvente de scindare pentru Eco RI si Bam HI s-au constituit aceste secvente si la capetele 5’ ale genelor sintetizate chimic. Prin scindare plasmidei cu Eco RI si Bam HI rezulta capete adezive 5’ AATTC si 5’ CTAG. Acestea s-au grefat pe cele doua gene chimice pentru a ingloba in pRB 322 noua informatie.
Introdusa in E.coli, aceasta noua plasmida va putea sintetiza o serie de polipeptide care vor contine si secventa de aminoacizi a lantului A si B. Cum fiecare lant incepe cu formil-metionina produsul de biosinteza se va trata cu BrCN care ataca doar metionina si cliveaza lanturile diverselor polipeptide hidride, precursoare la nivelul acestora. In HCl 0.1N sau acid formic, la 20°C, are loc degajare de izociantat de metil volatil si hidroliza catenei cu formarea unei lactone homoserinice (Hsl) terminale si eliberarea capatului aminic (η=80-90%).
BrCN
XXX M lant A M lant B XXX ¾¾¾® XXX Hsl + lant A + lant B + XXX
H2O/H+
[ O ]
lant A + lant B ¾¾® HuIns
Problema in aceasta tehnica este ca randamentul de producere a acestor doua catene este altul pentru fiecare din ele si nic din totalul de proteine sintetizate de E.coli astfel tratate. In plus, noul caracter al tulpinilor obtinute se pierde in timp.
Toate tehnologiile de biosinteza care folosesc microorganisme manipulate genetic au probleme cu stabilitatea mutantului. Toti mutantii sunt instabili. Dupa un numar de multiplicari revin la forma parentala, mai naturale, mai salbatica, mai stabila (revertanti), prin eliminarea din gena a materialului nonself. Este o problema generala a geneticii: genomul mai “salbatic” castiga in competitia cu cel “artificializat”.
Se constata la E.coli RR I ca pastreaza noua plasmida pBR 322 doar cca. 60 cicluri de viata, 60 de generatii dupa care calitatiile de producator de insulina dispar. Dar aceasta este suficient sa produca din o celula 12 000 l de mediu de cultura cu un continut de biomasa de 10 g/l. Aceasta densitate de celule suficienta ca in ultimele 24 de ore, sau mai putin , sa genereze HuIns, interferoni sau hormoni de crestere. Calitatea de inalt producator se pierde odata cu pierderea plasmidei, si aceasta odata cu pierdera rezistentei la antibiotice pe care pBR 322 o induce. E bine asa, pentru ca astfel am invada lumea cu bacterii rezistente. In cateva ore se sensibilizeaza la loc la antibiotice. De aici necesitatea unui stoc de cultura pura de bacterie manipulata-inalt productuva, ce se foloseste pentru fiecare initiere a fiecarei sarje.
Problema stabilitati devine esentiala cand se lucreaza cu volume mari sau in flux continuu. Scaderea costurilor impune folosirea unor tulpini cu mai multe copii ale plasmidei in genom, care sa ramana inalt prductivi mai mult timp.
Nu trebuie uitat ca in bioreactor concentratia de proteine utila depinde de continutul intracelular si extra celular, pe de o parte, si de cantitatea produsa si cea pierduta prin hidroliza din cauza proteazelor proprii celulei, pe de alta ( Cfin=Ctot – Chidr ). Apar doua aspecte: viteza de hidroliza depinde de accesibilitatea proteinelor si de reactivitatea proteazelor.
Proteinele mici sunt solubile in citoplasma si rapid hidrolizate de proteaze. Daca sunt excretate , ele au un timp de injumatatire de 10 ori mai mari. Pentru HuProIns, o proteina mica, timpul de injumatatiree este de cca. 2 min in citoplasma celulara si de 20-25 de min in periplasma de unde va fi excretata. Cu cat molecula e mai mica cu atat instabilitatea ei e mai mare. Proteinele de masa moleculara mare sunt insolubile sau putin solubile si mai putin susceptibile atacului cu proteaze celulare, care are loc doar in solutia apoasa. Din aceasta cauza, solutia sintezie lantului A si B individuale nu e cea mai buna. La asocierea cu o proteina mai mare, viteza de degradare hidrolitica a proteinei utile este mai mica din cauza solubilitatii mici a noii proteine “himera”. Se procedeaza la asociera cu β-galactozidaza. Proteinele himera β-gal-lant A sau β-gal-proinsulina se cumuleaza in celula si, din cauza concentratiei mari, se insolubilizeaza ca depuneri (incluziuni) citoplasmatice. Pentru recuperarea lor este necesara o eficienta dezagregare a peretilor celulari prin forfecarea in omogenizator la presiune inalta.
O a doua posibilitatet este de protejare a continutului de proteina intracelulara prin mutanti cu activitate proteolitica diminuata. De aici necesitatea maririi masei moleculare a proteinelor sintetizate de bacteriile manipulate si folosirea de mutanti deficienti in proteaze.
O marire a randamentului de producere a celor doua lanturi se realizeaza printr-o varianta ceva mai “naturala” (mai putin artificiala). In loc sa se forteze introducerea celor doua gene in pBR 322 apartinand E.coli se utilizeaza doua tulpini diferite, fiecare va fi dopata cu o plasmida cotinand gena pentru un singur lant. Pentru selectarea mai usoara a tulpinilor ce contin aceasta gena recombinata si marirea caracterului de “natural” se asociaza gena cu cea a β – galactozidazei (operonul lac) sau operonul sintezei triptofanului. Legatura se face prin intermediul unei metionine, care sa permite scindarea ulterioara. Se amplifica si identificarea celulelor purtatoare a noii gene. Coloniile bacteriilor producatoare de β – galactozidaza se coloreaza in albastru.
Separarea celor doua lanturi se face prin procedeele conventionale (Goeddel 1979, Riggs 1981). La sfarsitul biosintezei proteina β – gal –A (β- gal-B) atinge pana la 20% din proteina celulara, sub forma insolubila in corpusculi citoplasmatici. Prin distrugerea peretilor celulari omogenizatoare eficace si centrifugarea fazei solide se obtine un concentrat cu peste 50% concentratie (aparitia incluziunilor intracelulare coincide cu acumularea proteinei himere). Acesti corpusculi-incluziuni contin compusi in care catena A , catena B si proinsulina sunt legate de β – galactozidaza (operonul lac), de operonul triptofonului sau de portiuni din acesti operoni. Urmeaza sa se separe himerele prin precipitarea, apoi lanturile utile sa se obtina prin clivare cu bromcian, in acid formic 70%, la temperatura camerei, in 12 ore. Lanturile A si B s-au transformat in derivat S. sulfonat, care s-a putut purifica prin cromatografie pe ioniti si prin gel-cromatografie. Dupa purificare, cele doua catene se cupleaza prin oxidare cu aer.
1 BrCN
cultura 1 ¾® XXX-β gal – M (A)-XXX ¾¾® A ¾¾
2 Sep.
3 Purif. [O]
¾¾® Hulns
1 BrCN
cultura 2 ¾® XXX-β gal – M (B)-XXX ¾¾® B ¾¾
2 Sep.
3 Purif.
Bineanteles ca reactia nu este selectiva si se vor obtine mai multe produse de oxidare diferite prin modul de asamblare prin puntile cistinice (AOB,HSA Ç BHS,AOB,HSA Ç ASH,HSA Ç B Ç BSH etc.) dar in care produsul util, HuIns (AOB), este prezent in proportie de 80%. Prin A si B s-au figurat cele doua catene in pozitie inversa, iar prin È si Ç puntile cistinice. Aceste 20% de produse secundare se recupereaza, se reduc la catenele initiale si se recircula la oxidare.
A + B ¾¾® A Ο B + A Ο B + HSA Ç BSH + HSA Ç B È BSH
In acest procedeu, proteinele ce contin precersorii β –gal-A si β-gal-B formeaza abia 20% din totalul proteinelor aflate in mediul de cultura, ceea ce este foarte putin, desi mult mai mult decat precursorii obtinuti pri metoda anterioara.
O varianta a procesului este biosinteza proinsulinei. Aceasta nu are efecte terapeutice, dar se scindeaza usor la HuIns in vivo la nivelul pancreasului sau in vitro cu tripsina. Avantajul este ca se poate scurta tehnologia de purificare a HuIns prin aceea ca din biosinteza rezulta un precursor care urmeaza sa fie scindat, enzimatic de exemplu. Practic se lucreaza doar cu jumatate din etapele tehnologice si procesul e finalizat odata cu purificarea produsului clivat. HuIns revine la un pret mult mai scazut decat cel al procesului cu doua tulpini si oxidare finala.
H2O
Proinsulina ¾¾® HuIns + lantul C
enz
Clivarea este usurata de faptul ca legatura intre lantul C si celelalte doua se fac prin resturi de aminoacizi puternic bazici : Arg si Lis. Ori aceasta sugereaza ca hidroliza enzimatica sa se faca de ex. cu tripsina. Inevitabil va rezulta si Arg- Ins, cu un rest pastrat la un capat carboxilic al lantului B, care se elimina prin acelasi tratament cu tripsina sau cu o proteaza activa asupra capatului carboxilic.
De interes doar academic se bucura biosinteza pre-proinsulinei de sobolan (Ulrich,1977). Aceasta este atasata de un pre-peptid suplimentar de 20 de aminoacizi, la capatul aminic al proinsulinei: H-(prepeptid)-(catena B)-(lant C)-(catena A)-OH. S-a separat mARN ppIns din celulele pancreatice si s-a sintetizat gena corespunzatoare cu revers-transcriptaza virusului mieloblastozei aviare, careia mARN i-a servit drept matrita. Din sinteza rezulta hibridul ARNm – ADNc, din care se elimina cu alcalii 0.3M polinucleotidul ARN, se re foloseste revers-transcriptaza pentru sinteza ADN bicatenar cu cADN matrita, iar scurta secventa monocatenara se elimina cu exonucleaza S l. La capetele drepte ale acestei gene s-au adaugat cu AND-ligaza T4 secvente de scindare (5’- CCA ½ AGCTTGG-3’) pentru HindIII, apoi cu aceasta restrictaza s-au constituit capetele adezive. Vehicolul s-a ale a fi plasmida pBM9, si ea posesoare a unui situs pentru HindIII. Amestecul din noua gena si plasmida pMB9 deschisa cu HindIII, s-a tratat cu AND- ligaza T4, drept care a rezultat o plasmida purtatoare a genei preproinsulinei de sobolan. Introdusa in E.coli χ1776, aceasta a produs peptidul corespunzator, care se poate scinda biochimic sau chimic.
O varianta de obtinere a insulinelor este sinteza chimica prin metoda blocurilor de 2-7 aminoacizi condensati in scurte secvente utile. Este o metoda eleganta, de rafinament stiintific dar care nu poate ramane decat una academica, fara aplicatii practice. Etapele multiple, in care fiecare aminoacid se protejeaza, activeaza, condenseaza, desacileaza este foarte laborioasa. Sunt cunoscute cateva sinteze (de ex. Maienhofer 1963), care au fost necesare pentru confirmarea structurii si studierea activitatii similariilor de sinteza.
Zincul este un microelement esential pentru organismele vii. Zincul (Zn) se afla ca bioconstituent al unor metalo-enzime: carboxipeptidaza, fosfataza alcalina, lactic-dehidrogenaza, glutamic-dehidrogenaze, aminopeptidaze, DNA-polimeraza, RNA-polimeraza, Zn-Cu superoxid-dismutaza precum si cofactor in sensul de “efector metabolic” cu rol activator al unor altor unzime: arginaza, enolaza, oxalacetic-decarboxilaza, izomeraza, aldolaza. De asemenea, intervine in actiunea unor hormoni: insulina (in structura acesteia aflandu-se cca. 0.153% Zn),hormoni gonadotropi hipofizari, favorizand fecundatia.